Пермеабілізація сприяє проникненню фарбувальних реагентів у клітини. Знову промийте клітини PBS, щоб видалити пермеабілізуючий розчин. Приготуйте фарбувальний розчин, розбавивши
594 Фалоїдин відповідно до інструкції виробника.
Жоден фалоідин не є проникним для клітин і тому не слід використовувати на живих клітинах. Флуоресцентно мічені фалоїдини, такі як кон’югат Phalloidin-iFluor® 488, можна використовувати лише для фарбування F-актину у фіксованих формальдегідом і пермеабілізованих зрізах тканини, клітинних культурах і безклітинних експериментах.
Кроки
- Фіксуйте клітини в 3-4% формальдегіді в PBS при кімнатній температурі протягом 10-30 хвилин. Попередня інкубація фіксованих клітин з 1% BSA у PBS протягом 20–30 хвилин може покращити фарбування. …
- Аспіруйте фіксуючий розчин і промийте клітини 2–3 рази в PBS. …
- Додайте робочий розчин кон’югату фалоїдину. …
- Спостерігайте клітини при Ex/Em 493/517 нм.
Фалоїдин здатний зв'язувати лише нативну четвертинну структуру F-актину. Щоб зберегти четвертинну структуру білка, слід використовувати фіксацію формальдегідом. Метанол та інші спирти денатурують нативну конформацію і тому несумісні з фарбуванням фалоїдином.
клітинна мембрана повинна бути непроникною для PI, оскільки фарбування Anexin/PI залежить від цієї властивості, щоб розрізняти некротичні або пізні апоптотичні клітини, що характеризуються втратою цілісності плазматичної та ядерної мембран. Це означає, що вам потрібно буде зафіксувати та забезпечити проникність клітин для фарбування PI.
Проникнення клітин Для антигенів, які знаходяться всередині клітини, потрібна пермеабілізація плазматичної мембрани, щоб дозволити проникнення антитіл.. Для антигенів на поверхні клітин пермеабілізація не потрібна і може перешкоджати оптимальному фарбуванню.