Продукт збирання з комплекту для клонування GeneArt Gibson Assembly EX — це молекула ДНК з ковалентним зв’язком, яку можна трансформувати в хімічно компетентні або електрокомпетентні клітини. Висока ефективність клонування від 95% до 100% було отримано в кожному випадку.
молярне співвідношення 1:1. Щоб досягти оптимальної ефективності збірки, використовуючи 4-6 фрагментних збірок, використовуйте a Молярне співвідношення 1:1 кожна вставка:вектор. Загальний об’єм неочищених ПЛР-фрагментів у реакції збірки не повинен перевищувати 20%.
Одним із недоліків техніки складання Gibson є те, що процес найкраще працює з фрагментами понад 200 нуклеотидів. Можливо, це пов’язано з тим, що екзонуклеаза може пережувати цілий фрагмент довжиною менше 200 нуклеотидів до того, як можуть відбутися етапи відпалу та полімеризації.
Реакція розрахована на проведення при 50°C, причому всі ферменти вибрані за їх стабільністю та активністю при цій температурі. Класична реакція Gibson Assembly може призвести до помилок на з’єднаннях фрагментів і не працює з одноланцюговими або короткими фрагментами.
Протокол складання:
| Рекомендована кількість фрагментів для складання | ||
|---|---|---|
| Загальна кількість фрагментів | 0,02–0,5 пмоль* X мкл | 10 мкл |
| Gibson Assembly Master Mix (2X) | 10 мкл | 10 мкл |
| Деіонізована H2O | 10-Х мкл | 0 |
| Загальний обсяг | 20 мкл*** | 20 мкл |
Продукт збирання з комплекту для клонування GeneArt Gibson Assembly EX — це молекула ДНК з ковалентним зв’язком, яку можна трансформувати в хімічно компетентні або електрокомпетентні клітини. Висока ефективність клонування від 95% до 100% було отримано в кожному випадку.